您是否曾想過有這樣一類疫苗，既能對抗各種致命病毒，又無需擔心可能帶來的副作用？答案就是－－ＶＬＰｓ（Ｖｉｒｕｓ－Ｌｉｋｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）病毒樣顆粒疫苗。

什么是ＶＬＰｓ？

ＶＬＰｓ是由病毒單一或多個結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白顆粒，大多數(shù)ＶＬＰｓ的空殼結(jié)構(gòu)為二十面體或螺旋形結(jié)構(gòu)，由幾種特異的結(jié)構(gòu)蛋白組成，它們有著和真正病毒十分相似的特征，易于被免疫系統(tǒng)識別，并以與真實構(gòu)象相似的途徑呈遞病毒抗原，從而誘導(dǎo)強烈的免疫反應(yīng)，但卻不含有病毒的遺傳物質(zhì)，因此無法復(fù)制或引發(fā)疾病［１］。簡單地說，ＶＬＰｓ疫苗提供了讓免疫系統(tǒng)＂模擬演練＂的機會，以便在遇到真正的病毒時能立即作出反應(yīng)進行反擊，并且ＶＬＰｓ疫苗自帶佐劑效應(yīng)，相當于＂打游戲自帶外掛＂。您是否曾想過有這樣一類疫苗，既能對抗各種致命病毒，又無需擔心可能帶來的副作用？答案就是－－ＶＬＰｓ（Ｖｉｒｕｓ－Ｌｉｋｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）病毒樣顆粒疫苗。

ＶＬＰｓ作為亞單位疫苗的一種，因具有安全、高效、可實現(xiàn)鑒別診斷的突出優(yōu)勢，近年來也被認為是最有可能替代傳統(tǒng)滅活疫苗的最佳候選疫苗形式。ＶＬＰｓ疫苗的制備過程一般包括以下步驟：病毒結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建與克隆、宿主表達系統(tǒng)選擇、分離純化、分析鑒定等［２］。

ＶＬＰｓ疫苗的分類

根據(jù)原始病毒的結(jié)構(gòu)，ＶＬＰｓ疫苗可分為有包膜和無包膜兩類。無包膜的ＶＬＰｓ疫苗只包含由病毒的蛋白形成的顆粒，如諾瓦克病毒和戊型肝炎病毒，一般由原核表達系統(tǒng)和低級真核表達系統(tǒng)實現(xiàn)。有包膜的病毒除了病毒本身的蛋白外，還包含宿主的細胞膜，比如Ａ型流感病毒和乙型肝炎病毒，一般由真核表達系統(tǒng)實現(xiàn)。

圖１　乙肝病毒示意圖

ＶＬＰｓ疫苗優(yōu)勢在哪？

１）、安全性：ＶＬＰｓ不含復(fù)制酶和編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，缺乏復(fù)制能力；

２）、高效的免疫保護力：ＶＬＰｓ自組裝疫苗能夠激活機體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的抗體和細胞免疫應(yīng)答，提供長期、持久的免疫保護；

３）、廣泛適應(yīng)性：ＶＬＰｓ自組裝疫苗可針對不同病原體進行設(shè)計，包括病毒、細菌等，為多種傳染病的預(yù)防和治療提供了新的選擇；

４）、表達系統(tǒng)多樣性：大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞和植物等多種表達體系均可用于表達ＶＬＰｓ；

５）、穩(wěn)定性和易制備性：ＶＬＰｓ疫苗具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠在極端條件下保存，容易通過工程方法大規(guī)模制備，可實現(xiàn)穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)。

這么優(yōu)秀的疫苗，以前怎么沒聽說過？

其實不然，２０世紀８０年代以來，ＶＬＰｓ逐漸替代傳統(tǒng)疫苗成為疫苗制備的首選［３］，并且作為炎癥、疼痛、過敏、腫瘤等治療性疫苗，早已滲透在我們的生活當中。例如乙肝疫苗、戊肝疫苗、宮頸癌疫苗和流感疫苗等都是＂現(xiàn)役＂經(jīng)典的ＶＬＰｓ疫苗，并且由默沙東開發(fā)的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ，簡稱乙肝）疫苗作為全球首個ＶＬＰｓ疫苗早在１９８６年就已獲批上市，隨后以預(yù)防人乳頭瘤病毒、戊型肝炎病毒等為適應(yīng)癥的預(yù)防疫苗相繼上市。下圖為目前上市及在研ＶＬＰｓ疫苗統(tǒng)計結(jié)果：

圖２　上市及在研的ＶＬＰｓ疫苗

注：ＶＬＰｓ：病毒樣顆粒；ＨＰＶ：人乳頭瘤病毒；ＮＶ：諾如病毒；ＣＰ：衣殼蛋白；ＨＥＶ：戊型肝炎病毒；ｐｆｓ２５：惡性瘧原蟲表面蛋白２５；ＰｆＣＳＰ：惡孢子蛋白；Ｍ２ｅ：基質(zhì)蛋白２胞外結(jié)構(gòu)域；ＨＡ：血凝素；ＮＡ：神經(jīng)氨酸酶；Ｅ：包膜蛋白；ｇｐ４１：糖蛋白４１；－：未命名

ＶＬＰｓ疫苗的表達系統(tǒng)

ＶＬＰｓ常用表達系統(tǒng)包括大腸桿菌、桿狀病毒／昆蟲細胞、酵母及哺乳動物細胞、無細胞表達系統(tǒng)等，約有１７０種不同的宿主表達系統(tǒng)可用，目前已報導(dǎo)的ＶＬＰｓ疫苗約７０％基于真核表達系統(tǒng)，３０％基于原核表達系統(tǒng)，并且已有１００余種ＶＬＰｓ被制備及鑒定。不同表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點比較見下圖所示：

圖３　不同表達系統(tǒng)比較

ＶＬＰｓ疫苗的純化與組裝

病毒樣顆粒的純化主要包括４個步驟，分別是裂解、粗提、濃縮和精制［４］。

１、裂解：當宿主表達的組裝ＶＬＰｓ無法分泌至胞外時，純化時需要先對細胞進行裂解［５］，哺乳動物和昆蟲細胞一般采用去污劑處理，而高壓、超聲、研磨以及凍融等方法［６－７］則多用于細菌、酵母和植物細胞。裂解過程中最重要的是防止蛋白降解，因此需要根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)選擇合適的緩沖體系，并添加蛋白酶抑制劑和蛋白穩(wěn)定劑［８］。

２、粗提：這一步是將細胞碎片和大聚合物去掉［９］。離心是蛋白粗提過程中常用的方法，一般使用低速離心機或者連續(xù)流離心機［５］。

３、濃縮：這一步主要的目的是去除雜蛋白和提高目的蛋白濃度。濃縮的方法有很多，包括硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀、蔗糖氯化銫梯度超速離心、離子交換層析、疏水層析及親和層析等［１０］。

４、精純：精制的主要目的是去除宿主自身表達的蛋白質(zhì)和ＤＮＡ，同時去除工藝過程引入的雜質(zhì)。精純主要采取離子交換層析、膜裝置和分子排阻等方法。

５、組裝：由于不完全或者不規(guī)則的組裝會導(dǎo)致ＶＬＰｓ疫苗效果的下降，因此，有時需要對ＶＬＰｓ進行去組裝和重組裝處理，以提高ＶＬＰｓ的穩(wěn)定性、均一性和免疫原性［１１］。而且需要根據(jù)ＶＬＰｓ自身性質(zhì)選擇合適緩沖體系，例如ＨＰＶ１６Ｌ１?。郑蹋校蟮娜ソM裝需要在高ｐＨ、低鹽和還原劑的溶液下進行，重組裝則需要在低ｐＨ、高鹽和去還原劑的條件下進行［９］。

病毒樣顆粒的鑒定

在制備ＶＬＰｓ的過程中，要對ＶＬＰｓ的制備情況進行檢測，主要通過以下４個方面：性質(zhì)、含量、效果和純度。

１、性質(zhì)：ＶＬＰｓ性質(zhì)的檢測主要包括ＶＬＰｓ的形態(tài)、大小、氨基酸序列、相對分子質(zhì)量、降解修飾情況、中和表位、抗原特異性等方面［１２］。方法包括ＳＤＳ／ＰＡＧＥ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ法、ＥＬＩＳＡ法、表面等離子體共振技術(shù)、投射電子顯微鏡法、免疫電鏡法、蛋白質(zhì)測序法、質(zhì)譜法等。

２、含量：主要的方法有ＥＬＩＳＡ法、ＢＣＡ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、紫外分光光度法等。

３、效力：證明ＶＬＰｓ疫苗效果的關(guān)鍵，主要包括體外試驗，如血凝抑制試驗；體內(nèi)試驗，如免疫試驗、攻毒試驗等。

４、純度：檢測純化和精制效果的關(guān)鍵，同時也與能否用于臨床試驗相關(guān)。純度檢測主要檢測ＶＬＰｓ結(jié)構(gòu)蛋白的純度、ＶＬＰｓ的組裝率、宿主ＤＮＡ和蛋白的殘余、蛋白核酸復(fù)合物的多少等。主要的方法有ＥＬＩＳＡ法、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ法、ＤＮＡ染色方法、瓊脂糖凝膠電泳遲滯試驗、透射電鏡檢測法等［８］。

ＶＬＰｓ疫苗的未來

ＶＬＰｓ疫苗，作為一種無活性、高效率的疫苗制備方式，正在改變我們對未來免疫防御的認知。同時由于其對目標宿主細胞的天然親和力特性已被用于如基因治療、靶向給藥等細胞靶向應(yīng)用，也可與探針結(jié)合應(yīng)用于生物成像或揭示病毒感染機制等基礎(chǔ)研究當中，ＶＬＰｓ代表著免疫科學(xué)的前端進展，提供了一種強大且安全的工具為人類健康做貢獻。

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